【MTT实验操作流程】MTT实验是一种广泛应用于细胞生物学研究中的方法，主要用于评估细胞的存活率和增殖能力。该实验基于线粒体脱氢酶对MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）的还原作用，从而形成紫色结晶物，通过分光光度计测定其吸光度来反映细胞活性。

以下为MTT实验的标准操作流程：

一、实验前准备

1. 材料与试剂准备

- MTT溶液（通常为5mg/mL）

- PBS缓冲液

- 二甲基亚砜（DMSO）

- 细胞培养基

- 96孔板或6孔板

- 细胞株（如HeLa、HepG2等）

2. 仪器设备

- 倒置显微镜

- 酶标仪（用于检测OD值）

- 离心机

- 无菌操作台

二、细胞接种

1. 将目标细胞以适当密度接种于96孔板中，每孔约100μL。

2. 每个实验组设置3个重复孔，同时设置空白对照孔（仅含培养基）。

3. 将培养板置于37℃、5% CO₂恒温培养箱中培养24小时，使细胞贴壁并进入稳定生长状态。

三、药物处理（如需）

1. 根据实验设计，在细胞培养至合适阶段后加入不同浓度的药物或处理因素。

2. 处理时间根据实验目的设定，一般为24–48小时。

四、MTT染色

1. 吸去培养基，用PBS轻轻洗涤细胞2次。

2. 每孔加入100μL MTT溶液（终浓度为0.5mg/mL）。

3. 将培养板放回培养箱继续孵育4小时左右，直至形成明显的紫色结晶。

五、溶解结晶

1. 吸去培养基及MTT溶液。

2. 每孔加入150μL DMSO，轻轻振荡10分钟，使结晶完全溶解。

3. 若有未完全溶解的情况，可延长振荡时间或短暂离心。

六、检测与数据分析

1. 使用酶标仪在570nm波长下测定各孔的吸光度（OD值）。

2. 计算各组细胞的相对存活率：

$$

\text{细胞存活率} = \frac{\text{实验组OD值} - \text{空白组OD值}}{\text{对照组OD值} - \text{空白组OD值}} \times 100\%

$$

3. 对数据进行统计分析，绘制剂量-效应曲线或比较不同处理组之间的差异。

七、注意事项

- 实验过程中应保持无菌操作，避免污染。

- MTT溶液具有一定的毒性，操作时应佩戴手套和护目镜。

- 不同细胞系对MTT的反应可能有所不同，建议预实验优化条件。

- DMSO溶解后应尽快检测，避免长时间放置导致OD值变化。

通过规范的操作流程和严谨的数据分析，MTT实验能够为细胞毒性、药物筛选、肿瘤研究等领域提供可靠的实验依据。掌握这一技术对于从事生命科学研究的人员来说至关重要。