【实时荧光定量PCR操作步骤-20250207190845】在分子生物学研究中，实时荧光定量PCR（qPCR）是一项关键技术，广泛应用于基因表达分析、病原体检测及基因组拷贝数测定等领域。为了确保实验结果的准确性与可重复性，规范的操作流程至关重要。以下为本实验室最新整理的qPCR操作指南，适用于2025年2月7日之后的实验流程。

一、实验前准备

1. 试剂与耗材检查

确保所有试剂（如SYBR Green Master Mix、引物、模板DNA等）均处于有效期内，并按要求保存（通常为-20℃或4℃）。同时检查移液枪、PCR管、96孔板等耗材是否齐全且无污染。

2. 仪器校准

在开始实验前，对PCR仪进行温度校准，确保各孔温差不超过±0.5℃。同时检查荧光检测模块是否正常工作，避免因设备问题导致数据偏差。

3. 引物设计与验证

引物需具备良好的特异性与扩增效率，建议使用Primer-BLAST等工具进行序列比对，排除非特异性扩增可能。若条件允许，应提前对引物进行梯度浓度测试，确定最佳使用浓度。

二、样本处理与模板制备

1. RNA提取与反转录

若为RNA模板，需先进行总RNA提取，使用Trizol法或商业化试剂盒，确保RNA完整性。随后进行反转录反应，生成cDNA。注意控制反转录温度与时间，避免酶活性下降。

2. DNA模板制备

对于DNA样本，应确保其纯度与浓度符合qPCR要求。可通过紫外分光光度计或荧光定量方法进行初步检测。

三、qPCR反应体系配置

1. 反应体系配制

按照试剂说明书配置反应混合液，通常包括：

- 2× SYBR Green Master Mix：10 μL

- 上游引物（10 μM）：0.5 μL

- 下游引物（10 μM）：0.5 μL

- cDNA/模板DNA：2 μL

- 无核酸酶水：补足至20 μL

注意：所有试剂需预先混匀，避免气泡产生；建议使用无菌枪头并采用双盲法操作以减少误差。

2. 加样与封板

将配制好的反应液加入96孔板中，使用透明封板膜密封，防止蒸发和交叉污染。建议每组设置3个重复孔，以提高数据可靠性。

四、PCR程序运行

1. 程序设定

根据所用试剂类型选择合适的热循环程序。一般步骤如下：

- 预变性：95℃，10分钟

- 循环阶段：95℃，15秒 → 60℃，60秒（共40个循环）

- 解链曲线分析：65~95℃，每0.5℃升温一次，持续5秒

2. 运行监控

实验过程中应密切观察仪器状态，确保无异常报警。若发现温度波动或荧光信号异常，应及时排查原因。

五、数据分析与结果解读

1. Ct值获取

实验结束后，通过软件导出Ct值（Cycle Threshold），即荧光信号超过基线阈值时的循环次数。Ct值越小，代表目标基因的初始拷贝数越高。

2. 相对定量计算

常用方法为2^(-ΔΔCt)法，需设置内参基因（如GAPDH、β-actin）进行标准化处理。建议使用Excel或专用软件（如qBase、Bio-Rad CFX Manager）进行数据处理。

3. 图表绘制与报告撰写

将结果以柱状图或折线图形式展示，注明实验条件、重复次数及统计学显著性（如p值）。最终形成完整的实验报告，供后续研究参考。

六、注意事项与常见问题排查

- 引物二聚体干扰：可通过优化退火温度或更换引物解决。

- 扩增效率不佳：检查模板质量、引物浓度及反应体系是否平衡。

- 荧光信号不稳定：确认仪器校准情况及试剂保存条件是否合规。

结语

实时荧光定量PCR作为现代生命科学研究的重要工具，其操作流程虽看似简单，但每一个细节都可能影响最终结果。因此，实验人员应严格遵守标准操作规程，结合实际需求不断优化实验方案，以提升数据的准确性和可信度。

版本号：20250207190845

发布单位：分子生物技术实验室